微生物群与生物钟调节宿主先天免疫的昼夜节律
原创 发布时间:2022-10-27 浏览次数: 2532 来源: 梁丽丽

核心提示:肠道中的许多生物过程表现出由生物钟控制,然而,肠道的独特之处在于它的许多昼夜节律也需要肠道微生物群;SFB节律性附着在肠上皮通过ILC3调节STAT3的节律,STAT3节律性表达使AMP表达产生节律,AMP节律性表达导致对感染的抵抗力呈现昼夜变化。


  一.研究背景

  宿主进食节律由生物钟控制,并且宿主进食节律与微生物群同步,以促进肠道先天免疫节律,生物钟通过控制宿主进食节律驱动分段丝状细菌(SFB)节律性附着在小肠上皮,抗菌蛋白的节律性表达是由小鼠肠道微生物群中SFB节律性附着肠上皮驱动的;其机制是SFB节律性附着在肠上皮激活了涉及第3组先天性淋巴细胞的免疫回路。该通路触发了肠上皮STAT3表达和激活的振荡,导致节律性抗菌蛋白表达,并导致对鼠伤寒沙门菌感染的抵抗力呈现昼夜周期中变化。


  几乎所有动物都遵循昼夜节律(进食和睡眠),喂养节律会导致宿主有节奏地接触食源性病原体。为了防止感染,哺乳动物肠上皮产生大量分泌的抗菌蛋白(AMPs)。这表明肠道先天免疫可能表现出昼夜节律;在哺乳动物中,生物钟是一个转录因子网络,在24小时周期内驱动基因节奏性表达。肠道中的许多生物过程表现出由生物钟控制,然而,肠道的独特之处在于它的许多昼夜节律也需要肠道微生物群;SFB节律性附着在肠上皮通过ILC3调节STAT3的节律,STAT3节律性表达使AMP表达产生节律,AMP节律性表达导致对感染的抵抗力呈现昼夜变化。


  二.研究结果

  1. 抗菌蛋白表达的昼夜节律取决于微生物群

  1)REG3G基因及其编码蛋白(REG3G)的表达呈昼夜节律性,ZT0的表达最低,ZT12最高,ZT0表达开始升高,ZT12表达降低(图1A-1D和S1)。在无菌小鼠中,REG3G的表达在所有时间点都较低,且没有节律性。

  2)其他上皮抗菌蛋白(AMP)也表现出需要微生物群的节律性表达。包括限制细菌铁摄取的AMP(LCN2)(图1E-1G)和限制细菌钙摄取的AMPS100A8(图1H-1J)。相反,其他先天免疫基因的表达是非节律性的。其中包括编码溶菌酶的Lyz1,及产生活性氮物种(Nos2)和粘液(Muc2)所必需的基因。



  图一 抗菌蛋白表达的昼夜节律取决于微生物群(A)QPCR检测常规(CV)和无菌(GF)小鼠小肠中Reg3G转录本的丰度;(B和C)CV和GF小鼠小肠的代表性免疫印迹;(D)在昼夜循环中CV和GF小鼠小肠中REG3G的免疫荧光检测,细胞核用 DAPI染色;(E)QPCR测量CV和GF小鼠小肠中Lcn2转录本丰度的昼夜循环;(F和G)CV和GF小鼠小肠的代表性免疫印迹;(H) qPCR测量CV和GF小鼠小肠中S100A8转录本丰度的昼夜循环;(I和J)CV和GF小鼠小肠的代表性免疫印迹;(K)QPCR 分析CV 和 GF小鼠小肠中Lyz1、Nos2 和 Muc2 转录本丰度的昼夜循环

  2. 分段丝状细菌节律性附着在肠上皮驱动微生物蛋白表达的昼夜节律

  1) SFB是驱动AMP节律性表达的微生物群成分;

  2) REG3G表达不能驱动SFB节律性附着;

  3) REG3G 被分泌到小肠粘液层中,在那里它限制了粘液相关细菌定植。






  图二 分段丝状细菌的有节律的附着在肠上皮驱动抗菌蛋白昼夜节律的表达 (A) SFB+ (Tac)和 SFB- (Jax)小鼠小肠中REG3G的免疫荧光检测,细胞核用DAPI染色;(D和E)SFP+(Dac)和SFB-(Jax)小鼠小肠绒毛的扫描电子显微镜;(F)与SFB (Tax)小鼠共同饲养14天的 SFB-(Jax)小鼠小肠中REG3G 的免疫荧光检测。细胞核用DAPI染色;(G和H)共同饲养小鼠小肠的代表性免疫印迹;(I和J)共饲养小鼠小肠绒毛的扫描电子显微镜;(K和L)SFB单克隆小鼠小肠绒毛的扫描电镜;(M)SFB单克隆小鼠小肠中REG3G的免疫荧光检测。细胞核用DAPI染色;(N和O)SFB单克隆小鼠小肠的代表性免疫印迹;(N和O)SFB 单克隆小鼠小肠的代表性免疫印迹,检测 REG3G、LCN2、S100A8和SDHA

  3. ILC3-STAT3信号通路驱动REG3G昼夜节律的表达

  1)骨髓细胞 TLR-MYD88 信号触发白细胞介素 (IL)-23的产生,从而引发ILC3产生IL-22。 IL-22 激活上皮细胞STAT3以驱动REG3G表达。SFB附着在肠上皮促使 ILC3-STAT3中继并刺激包括 REG3G在内的基因表达。

  2)证明ILC3驱动REG3节律性表达。Rorcgfp/gfp小鼠REG3G在ZT0和ZT12时的表达均较低【Rorcgfp/gfp小鼠抑制ILC3表达】,这一结果支持产生IL-22细胞驱动REG3G节律中的作用(图3A-3C)。然而,在缺乏重组激活基因1(Rag1)的小鼠中【1(Rag1)的小鼠表达ILC3】,在ZT0处REG3表达较低,在ZT12处表达较高,表明ILC3驱动REG3节律性表达。

  3)证明REG3G节律性的表达需要 STAT3,在Stat3△IEC小鼠中,REG3G在ZT0和ZT12处较低(图3A-3C),表明REG3G节律需要 STAT3。同样,在Stat3△IEC小鼠中,S100A8(图 3D 和 E)和LCN2(图3F和3G)在ZT0和ZT12 处的表达均较低,表明上皮 STAT3是多种AMP 节律性表达所必需的。

  4)非节律性溶菌酶表达在ILC3-STAT3信号通路破坏的小鼠中不受影响,表明该通路不是所有上皮AMP表达所必需的。





  图3 ILC3-STAT3信号接力驱动REG3G昼夜节律的表达 (A)不同小鼠小肠中REG3G的免疫荧光检测;(B和C)不同小鼠小肠的代表性免疫印迹;(D和E)Stat3DIEC小鼠小肠的代表性免疫印迹;(F和G)Stat3DIEC小鼠小肠的代表性免疫印迹。

  4. SFB驱动STAT3昼夜节律的表达和激活

  1)IL-23 和 IL-22的产生具有节律性且与REG3G 表达节律相对应。因此,ILC3-STAT3 通路需要细胞因子节律性表达。

  2)IL-22刺激上皮细胞STAT3的磷酸化从而激活STAT3,在SFB+小鼠中,STAT3的表达和激活呈节律性,与REG3、LCN2和S100A8的峰值表达一致(图4D和4E)。此外,在SFB-小鼠中,STAT3的节律性表达和激活减弱(图4D和4E),表明STAT3节律需要SFB。在REG3G-/-小鼠中,STAT3表达和激活的节律保持不变(图4G和4H),表明SFB驱动REG3G表达的节律。



  图4 SFB 驱动 STAT3 昼夜节律表达和激活的肠(A) 小肠 ILC3-STAT3 通路示意图;(B) 通过酶联免疫吸附试验 (ELISA) 测量小鼠小肠中的 IL-23;(C)通过ELISA测量野生型(WT)、Rorcgfp/gfp和Rag-1/-1小鼠小肠中的IL-22;(D和E)SFB+(Tac)和SFB-(Jax)小鼠小肠的代表性免疫印迹;(F) WT和Stat3DIEC小鼠的免疫印迹;(G和H)在REG3G-/-小鼠中维持STAT3和pSTAT3节律;(I和J)SFB-(Jax)小鼠小的代表性免疫印迹;(K和L)SFB 单克隆小鼠小肠的代表性免疫印迹,检测 STAT3、pSTAT3 和 SDHA;(M)QPCR 测量小肠上皮细胞中的Stat3转录物丰度。

  5. 生物钟调节SFB附着在肠上皮的昼夜节律,驱动STAT3和REG3G节律性表达

  1) SFB附着在Rev-erba -/-小鼠中具有有节律性,与pSTAT3和REG3G的节律一致(图 5A-5G)。因此,REG3G 节律不需要 REV-ERBa,表明这些节奏是通过不同的机制产生的。

  2) 与野生型小鼠相比,Clock△19/D19 小鼠的 SFB 附着节律、pSTAT3 水平和 REG3G 表达减弱(图 5A-5G)。因此,有节奏的 REG3G 表达需要生物钟基因Clock。



  图5生物钟调节SFB附着在肠上皮中的昼夜节律,驱动 STAT3和REG3G节律性表达(A和B)WT、Rev-erba和ClockD19/D19小鼠的肠上皮的扫描电子显微镜;(C)WT、Rev-erba和ClockD19/D19小鼠小肠中REG3G的免疫荧光检测,细胞核用DAPI染色;(D和E)WT、Rev-erba和ClockD19/D19小鼠小肠的代表性免疫印迹;(F和G)WT、Rev-erba和ClockD19/D19小鼠小肠的代表性免疫印迹;(H和I)测量WT、Rev-erba和Clock19/D19小鼠的食物摄取率。

  6. 生物钟影响宿主的进食节律,从而调节SFB附着在小肠上皮的节律

  1)生物钟影响肠道微生物群的数量、组成和功能的节律,主要是通过调节宿主进食的时间。

  2)小鼠是夜间活动的,夜间进食量最大(图 5H、5I 和 S7)。同样,Rev-erba -/-小鼠有节奏地进食,夜间进食量最大(图 5H 和 5I),Clock△19/D19小鼠缺乏明显的进食节律(图 5H 和 5I),表明Clock生物钟基因控制小鼠进食节律。

  3)Clock△19/D19小鼠的进食节律紊乱导致REG3G节律减弱。

  4)禁食小鼠的SFB附着数量显著减少,但这是由于SFB的整体消耗(图6I)。REG3G和pSTAT3节律在禁食小鼠中消失(图6H-6L)。这些数据支持喂养促进SFB有节律附着在肠上皮的观点,SFB驱动STAT3、pSTAT3和REG3G的节律性表达。表明喂养是SFB附着在肠道的必要条件。





  图6 生物钟调控宿主的进食节律,进而调节SFB附着在肠上皮的节律(A和B)测量白天或夜间喂养的小鼠的食物摄取率(A),白天和夜间的总食物摄入量(B);(C和D)日间或夜间喂养小鼠的肠上皮的扫描电子显微镜;(E-G)夜间喂养(E)或日间喂养(F)小鼠小肠的代表性免疫印迹,检测REG3G、STAT3、pSTAT3和SDHA;(H和I)自由进食或禁食(24小时)小鼠肠上皮的扫描电子显微镜;(J和K)随意喂养或禁食(24小时)小鼠小肠的代表性免疫印迹,检测REG3G、STAT3、pSTAT3和SDHA。

  7. SFB通过STAT3作用导致宿主对沙门氏菌感染耐药性呈现昼夜节律变化

  1)鼠伤寒沙门氏菌是一种天然的小鼠病原体,在缺乏抗生素的情况下会在肠道内定居,从而耗尽SFB,从而抑制先天免疫的节律。

  2)宿主对鼠伤寒沙门氏菌感染具有节律性。ZT12的SFB+小鼠的鼠伤寒沙门氏菌负荷高于ZT0(图7B)。与STAT3在ZT12处激活最高,在ZT0处激活最低(图4A和4B)。SFB-小鼠的细菌负荷在昼夜循环中是相似的(图7C)。此外,链霉素治疗降低了SFB+小鼠体内的SFB丰度(图7D),并消除了鼠伤寒沙门菌负荷的时间依赖性变化(图7e和7F),表明SFB引起了耐药性的时间依赖性变化。

  3)在ZT0和ZT12感染时,Stat3△IEC小鼠的细菌负荷数没有节律(图7G),这与SFB通过STAT3促进节律性AMP表达的事实一致(图3)。因此,SFB通过STAT3驱动宿主对鼠伤寒沙门氏菌感染抗性呈现节律性变化。



  图7 SFB 通过STAT3 发挥作用,对沙门氏菌感染的抵抗力呈现昼夜变化 (A)鼠伤寒沙门氏菌口腔感染测定细菌负荷;(B和C) 感染鼠伤寒沙门氏菌 (每只动物 108 CFU) 的野生SFB+(Tac)小鼠(B)和SFB-(Jax)小鼠(C)的回肠细菌负荷;(D)QPCR分析来自 SFB+ (Tac)小鼠和SFB-(Jackson)小鼠在链霉素治疗前后两个时间点 (ZT0和ZT12) 的粪便中的SFB丰度;(E和F)链霉素给药后24小时,感染鼠伤寒沙门氏菌(每只动物108 CFU)的野生型 SFB+(Tac)小鼠(E)和 SFB-(Jax)小鼠(F)回肠中的细菌负荷;(G) 感染鼠伤寒沙门氏菌的 Stat3DIEC小鼠回肠中的细菌负荷(每只动物 108 CFU);(H) 鼠伤寒沙门氏菌口腔感染测定致死率;(I 和 J)感染鼠伤寒沙门氏菌(每只动物107 CFU)的野生型SFB+(Tac)小鼠(E)和SFB-(Jax)小鼠(F)的致死率。

  三 结论

  生物钟使生理过程与昼夜光周期相协调,使动物能够预测环境的变化。在这项研究中,我们发现生物钟将肠道固有免疫与宿主摄食节律相协调,从而预测接触食源性细菌的可能性。其机制涉及宿主摄食节律的昼夜时钟夹带,从而产生振荡的SFB上皮附着。节律性SFB附着刺激髓样细胞-ILC3免疫回路,该免疫回路驱动上皮STAT3表达和激活的节律。STAT3节律引起AMPs的振荡表达,包括REG3、LCN2和S100A8。这样,宿主的摄食节律与肠道固有免疫的节律同步。

  1.肠道先天免疫的昼夜节律产生抗感染的昼夜变化

  AMP表达的节律导致对肠道感染的先天免疫每日波动,STAT3 控制的先天免疫节律导致感染抗性在昼夜光照周期内发生变化。此外,感染易感性的每日变化取决于SFB,这表明微生物群会产生感染抗性的每日波动。

  2.SFB 将先天免疫与宿主喂养同步

  生物钟使用光信号使代谢途径的表达与食物摄入同步,从而有效利用能量资源。我们的研究结果表明,食物摄入也与先天免疫效应子的表达同步。该机制涉及生物钟驱动的宿主食物摄入节律,通过微生物群作用促进先天免疫的日常波动。

  3.治疗意义

  慢性睡眠中断与人类感染的易感性增加有关。例如,与白天工作的人相比,晚上工作的人对细菌和病毒感染的易感性更高。我们的研究结果表明,改变的进食行为可能是一个致病因素。通过确定生物钟驱动微生物群功能昼夜节律的机制,我们可以开始阐明微生物群的节律功能如何影响宿主免疫。这些研究可能会导致定时治疗干预和疫苗接种的发展。

  4.研究的局限性

  我们的研究阐明了宿主的摄食节律如何在肠道先天免疫中产生节律,从而可以预期接触食源性和环境细菌。然而,关键问题仍然存在。首先,我们的研究使用了单一的感染模型,鼠伤寒沙门氏菌。因此,剩下的问题是其他肠道病原体是否也会由于这些相同的先天免疫节律而表现出每日的抗药性变化。然而,探索其他感染模型可能具有挑战性,因为许多肠道细菌感染的小鼠模型需要事先进行抗生素治疗,这会耗尽有节奏的 AMP 表达所需的 SFB。第二个关键问题是AMP在人类肠道中的表达是否也是有节律的。虽然 SFB 存在于人类肠道微生物群中,但尚不清楚它们是否表现出与人类肠道上皮细胞的节律性附着,或者是否其他上皮粘附成员人类微生物群显示出可以驱动有节奏的 AMP 表达的日常依附节律。回答这个问题将开始解决人类微生物群是否像小鼠微生物群一样,将摄食节律与先天免疫节律同步,以预测病原体暴露。

  文献链接:https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867421008278

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