噬菌体受体结合蛋白是检测人类标本中大肠杆菌一种有前途的工具
原创 发布时间:2022-09-21 浏览次数: 33 来源: 何嘉欣

核心提示:大肠杆菌是一种常见的病原体,会引起多种危及生命的疾病,如肺炎、脑膜炎、败血症、肠道疾病和尿路感染等。正确和快速的细菌鉴定对于及时和有针对性的抗菌治疗至关重要。


  摘要:大肠杆菌是一种常见的病原体,会引起多种危及生命的疾病,如肺炎、脑膜炎、败血症、肠道疾病和尿路感染等。正确和快速的细菌鉴定对于及时和有针对性的抗菌治疗至关重要。噬菌体受体结合蛋白(RBPs)对细菌表面表现出高度特异性,因此作为生物识别元件特别有吸引力,可能在细菌检测中赋予高灵敏度和特异性。在本研究中,研究人员首次阐明了源自 T7多价噬菌体285p的重组RBP (Gp17)在不同生存状态下识别大肠杆菌的潜力。此外,研究人员还使用了一种结合磁粉检测(MT)和荧光荧光分光光度计的诊断方法,证明了Gp17具有在大约1.5小时内特异性检测各种人体标本(如全血、粪便、尿液和唾液)中的大肠杆菌的能力。

  一、实验流程:


  图1 RBP mCherry-Gp17 在不同的生存状态下针对大肠杆菌进行检测,并用作

  检测人体样本中大肠杆菌的识别分子。

  二、实验结果

  1、生物信息学分析

  基因gp17被鉴定为来自 pyophage (PYO) 混合物的大肠杆菌噬菌体 285p 中的编码尾纤维蛋白的基因。 将编码的蛋白质(GP17)的序列与NCBI 数据库中的其他噬菌体尾部蛋白的同源性进行了比较。结果表明,Gp17与其他大肠杆菌噬菌体具有同源性,如噬菌体BA14(72%同源性)、噬菌体 PhiV-1 (71%同源性) 和噬菌体 P483 (60%同源性)。此外,Gp17 与肠杆菌属(肠杆菌属噬菌体 PZJ0206 尾部,95%)、沙门氏菌(沙门氏菌噬菌体 BSP161 尾部,88%)、耶尔森氏菌(耶尔森氏菌噬菌体 PYPS50 尾部,87%)和欧文氏菌(欧文氏菌噬菌体 FE44 尾部,73%)都具有同源性。此外还发现GP17的N端结构域与phage_T7_tail_fiber家族匹配。

  2、mCherry-Gp17的功能分析

  鉴定Gp17为潜在的RBP后,将该蛋白表达纯化。对该蛋白进行功能分析,确定其对靶菌和其他菌种的识别结合能力。通过荧光显微镜观察到细胞发出红色荧光,因为Gp17与报告蛋白mCherry (mCherry-Gp17)融合。如图2所示,该蛋白能有效结合大肠杆菌HB104细胞(图2A),而不能结合非靶菌肺炎克雷伯菌HB11(图2B)或金黄色葡萄球菌HB22(图2C),因此选择临床分离的大肠杆菌HB104作为代表菌株进行进一步的检测。


  图2 Gp17与目标大肠杆菌细胞孵育后的荧光显微镜图像。

  3、mCherry-Gp17与不同存活状态细菌细胞结合能力的评估

  通过使用不同浓度的次氯酸钠诱导细胞进入活的、受损的、死的三种状态。在细胞与活力染料 SYTO9 和碘化丙啶 (PI) 一起孵育后,通过流式细胞术和荧光显微镜测定细胞活力,并进行 CFU 验证。图3A—C显示了在不同浓度漂白剂处理下使细胞存在不同状态。未经任何处理的细胞呈绿色(图3D),黄色(图3E)表明存在受损细胞,红色(图3F)表明存在死细胞。将 RBP mCherry-Gp17 与不同存活状态细胞结合,结果表明,该蛋白质能够准确识别活细胞(图 3G、4A)、受损细胞(图 3H、4B)和死细胞(图 3I、4C)。


  图3 荧光显微镜检测mCherry-Gp17与不同存活状态大肠杆菌细胞的结合


  图4 流式细胞术检测mCherry-Gp17与不同存活状态细胞的结合

  4、荧光光谱磁性夹心法用于检测加标人体样本中大肠杆菌

  将RBP GP17与 MT 和荧光分光光度法的优势相结合,分别用于细菌捕获和检测。以健康志愿者提供的尿液、血液、粪便和唾液中加入大肠杆菌HB104细胞作为样品与 mCherry-Gp17 一起孵育,然后使用MNPs分离细胞,并在分光荧光计上测量所得荧光信号。对磁富集后的上清液和洗涤液进行CFU计数分析,细菌捕获效率如图5所示。结果表明,该方法对存在于不同人类生物样本中的大肠杆菌HB104具有较高的细菌捕获效率(超过87%),证明了该方法对从复杂样本基质中回收细菌细胞的有效性。荧光光谱测定结果与洗涤步骤后残留的共轭mCherryGp17-bacteria-MNPs产生的荧光信号相对应,如图6所示,在不同的人类生物样品中获得的大肠杆菌HB104荧光信号(荧光信号大于900 a.u)与阴性对照(即非靶标金黄色葡萄球菌HB22)和经过相同处理过程的无细菌样品(荧光均值小于300 a.u)之间有统计学显著差异(p值< 0.0001),这说明将 Gp17 作为探针,它能够在不同的人类生物基质中准确地检测出大肠杆菌。


  图5在不同类型的人体样本中对大肠杆菌HB104和金黄色葡萄球菌HB22

  进行磁性夹心测定中获得的细菌捕获效率

  图6在不同类型的人体样本中对大肠杆菌HB104、金黄色葡萄球菌HB22

  及对照进行荧光光谱结果

  三、结论

  总体而言,研究人员证明了 RBP 具有识别不同生存状态大肠杆菌菌株的能力。此外,当RBP与MT方法和分光光度法相结合时,无需复杂的样品处理过程,Gp17 能够特异性识别和检测复杂人类生物样本中的大肠杆菌,这揭示了在生物传感技术中使用 RBP 作为特殊探测元件的可行性。

  参考文献:Costa Susana P. et al. A Phage Receptor-Binding Protein as a Promising Tool for the Detection of Escherichia coli in Human Specimens [J]. Frontiers in Microbiology, 2022, 13 : 871855-871855.

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