通过噬菌体长尾纤维蛋白固定磁性纳米粒子,实现快速、超灵敏检测沙门氏菌
原创 发布时间:2022-09-19 浏览次数: 116 来源: 王梓萌

核心提示:由沙门氏菌属细菌引起的沙门氏菌病被认为是第二大食源性感染疾病,为了及早预防食源性疾病暴发,沙门氏菌的快速准确监测和检测至关重要。然而,普通的检测方法,获得结果至少需要3天,该方法不适用于食品样品的快速分析,特别是对于保质期较短的即食食品的检测。


      目前比较实用的检测技术中,实时荧光定量PCR应用范围最广。然而,来自食物基质的抑制因素和细菌水平的初始低丰度会影响qPCR的效果。常用的解决方案是富集培养,但培养时间较长,还会出现初始细胞的损失等现象。因此,在qPCR分析之前,应采用有效且可靠的方式从受污染的食品样品中分离和富集细菌细胞;而磁性纳米粒子(MNPs)可有效富集靶细菌,靶细菌细胞的选择性识别和结合通常通过MNP与特定适配子和抗体的功能化来实现。本文采用的方法是,用噬菌体尾部纤维蛋白(TFP)包裹MNP。因TFPs来源于噬菌体和细菌的共同进化过程,因此编码为对宿主菌株的特定识别,无需耗时且耗费人力的筛选过程,且较容易大量生产。因此,TFPs具有巨大的潜力,可用作生物探针,与MNP一起功能化,用于靶细菌的特定分离和富集。

  在这篇文章中,作者使用一株可感染多株沙门氏菌的噬菌体STP4-a,其长尾纤维蛋白(称为LTF4-a)由形成STP4-a粘附尖端的亚基gp37和gp38组成;作者将gp37和gp38在大肠杆菌中共表达形成重组LTF4-a,然后将其功能化到MNP上以产生用于检测沙门氏菌的生物探针,在复杂食品基质中建立了一种快速且超灵敏的沙门氏菌检测方法,该方法允许在3小时内达到7 CFU / mL的检测限。

  重组LTF4-a的表征


  图1:蛋白LTF4-a的表征

  A图为表达载体的构建,其中gp57A是长尾纤维形成伴侣,为了最大限度地提高gp38的宿主受体结合能力,在LTF4-a的N端加入6×His-tag和3赖氨酸帽,使用高纯度的大肠杆菌表达系统成功获得重组LTF4-a蛋白,产量为6-8mg / L;B图为表达蛋白的SDS-PAGE验证结果。


  图2:探究LTF4-a的结合能力

  为了确定LTF4-a是否能够结合沙门氏菌细胞,将FITC标记的重组LTF4-a与鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028细胞一起孵育,并在荧光(FL)显微镜下检查(图2)。在FL显微镜下在鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028细胞上观察到绿色荧光。


  图3:探究生物探针的细胞结合能力

  为探究生物探针的细胞结合能力,将该生物探针和鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028共孵育后,用TEM观察细菌形态,如图3所示。结果表明,该探针不会影响细菌形态,且可有效结合岛细菌表面。


  图4:优化生物探针的反应条件

  对LTF4-a-MNP生物探针的沙门氏菌细胞结合效率进行优化,分别从(1)LTF4-a-MNP的单反应体积,(2)LTF4-a-MNP与沙门氏菌培养物的孵育时间,(3)反应溶液的pH值,以及(4)反应溶液中的NaCl浓度四个条件进行优化。结果如图4所示,红色柱子表示最佳的反应条件。

  对生物探针检测特异性的探究,将所有测试用的细菌浓度调整一致,结果表明生物探针对沙门氏菌的回收效率不受到其他菌株的影响(图5)。


  图5:探究生物探针的检测特异性

  评估生物探针在食物基质中的效果,结果表明,该探针在牛奶、生菜、鸡蛋中的细菌回收率几乎为100%,且该探针在4℃下保存6个月后回收效率仍然保持高水平,即说明该探针可在4℃下保存数月。


  图6:探究生物探针在食品基质中的作用效果

  探究LTF4-a-MNP生物探针在实际应用中的潜力。基于LTF4-a-MNP的分离和富集(A)PBS,(B)牛奶,(C)生菜和(D)全蛋样品后,鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028分析的qPCR线性拟合曲线。其中,1:阴性对照,2:7 CFU/mL,3:101CFU/mL, 4: 102CFU / mL,5:103CFU/毫升,6:104CFU / mL,7:105CFU/mL。

  根据qPCR结果,所有测试样品的回归曲线均具有良好的线性范围,LOD值为7 CFU / mL,凝胶图像表明PCR扩增子的产生与沙门氏菌的浓度成正比。


  图7:生物探针在实际应用中的作用效果

  结论:

  本研究建立了一种快速、超灵敏的复杂食品基质沙门氏菌检测方法,检测限为7 CFU/mL,检测时间为3h,重组LTF4-a与MNP偶联用作特异性亲和配体,用于筛选来自不同食品样品的沙门氏菌细胞,并与qPCR进一步结合,用于从预浓缩样品中特异性和灵敏检测目标微生物细胞。


  参考文献:

  Wang L, Lin H, Zhang J, Wang J. Phage long tail fiber protein-immobilized magnetic nanoparticles for rapid and ultrasensitive detection of Salmonella. Talanta. 2022 Oct 1;248:123627. doi: 10.1016/j.talanta.2022.123627. Epub 2022 May 30. PMID: 35661002.

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