环介导的等温扩增(LAMP)中基本步骤的动力学表明,启动过程中链的侵入是限速的
原创 发布时间:2023-01-17 浏览次数: 58 来源: 王楚芳

核心提示:事实上,包括杂交酶和硫代磷的两种底物使LAMP即使在40◦C这样的低温下也能继续进行,否则底物侵入的速率限制障碍将很难克服。


  环介导的等温扩增(LAMP)已被证明比聚合酶链式反应(PCR)更容易实施,用于临床点诊断测试。然而,LAMP的潜在机制很复杂,LAMP中主要步骤的动力学还没有完全阐明,这阻碍了LAMP的合理发展。

  在这里,我们描述了LAMP中基本步骤的动力学特征,并表明:(i)链入侵/起始是LAMP反应中的限速步骤;(ii)环引物在加快起始速度方面起着重要作用,并且不仅仅在指数扩增阶段起作用;(iii)BST-LF聚合酶的链置换合成相对较快(125nt/s),在线形和发夹模板上都是进行的,尽管在高GC含量的模板上会有一些中断。在这些数据的基础上,我们能够开发出一个动力学模型,将单个动力学实验与整体LAMP反应联系起来。该模型为开始理解和改进LAMP反应提供了一种现成的方法。例如,它预测模板核酸的热变性应该提供更好的途径进入限速引物入侵步骤。

  在这方面,我们先前已经证明,通过在更高的温度(72-74◦C)下用改进的聚合酶变异体进行扩增,LAMP可以被加速。类似地,变性DNA二级和三级结构的杂交体(尿素、胍)对LAMP的加速作用,可能部分是由于在起始和指数扩增过程中(即结合FIP、BIP、LF和LR),促进了引物的入侵和折叠结构的形成。硫代硫酸盐的修饰被认为通过改善双链末端的茎环的形成和增强随后的引物结合来增强LAMP,特别是在较低的温度下。

  事实上,包括杂交酶和硫代磷的两种底物使LAMP即使在40◦C这样的低温下也能继续进行,否则底物侵入的速率限制障碍将很难克服。这里开发的分析方法对LAMP的机理提供了重要的见解,总体模型对于设计更灵敏和更快的LAMP反应应该是至关重要的。我们使用的动力学方法可能会被证明对其他等温DNA扩增方法有借鉴作用。

  原文链接:http://dx.doi.org/10.1093/nar/gkac1221

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